Poisson分布总体均数为λ,则总体方差σ2=λ。
在FQ-PCR实际检测过程中,扩增反应体积为25微升~50微升,不能进一步增加,加入到反应体系的DNA模板(DNA提取后的上清液)的体积也只能是2微升~20微升不能进一步增加。为了在检测T为1拷贝/1μl的样本时有好的重复性,试剂生产商只能通过增加DNA提取后的上清液中的DNA拷贝数,使检测结果的分布向正态分布逼近,从而减小检测结果间的变异系数。
当T为1拷贝/1μl,试剂A检测时取质控物100μl、加等量DNA提取液、加热、加提取后的2μl上清液作模板进行扩增检测,此时抽样单位为1μl质控物,T相当于1(拷贝/抽样单位),检测结果间的变异系数CV=100%,就会得出重复性不好的结论;而检测时取质控物100μl、加等量DNA浓缩液、浓缩后的沉淀加DNA提取液20μl、加热、加提取后的2μl上清液作模板进行扩增检测,此时的T相当于10(拷贝/抽样单位),变异系数CV=31.6%,结果间的变异系数将大大降低。
由公式CV=λ0.5/λ可知,当待测样本的总体均数为λ=1(拷贝/抽样单位)时,无论多“规范”的试剂其检测结果间变异系数CV至少是100%。