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脂血、黄疸、溶血、血清标本不同储存温度及时间对HBV DNA定量结果测定无影响 乙型肝炎病毒(HBV)在慢性乙型肝炎的发生及发展过程中发挥着举足轻重的作用。乙型肝炎病毒核酸(HBV DNA)的定量测定在乙型肝炎病人的临床用药、治疗监测及判断预后方面具有重要的意义［1］。聚合酶链反应(PCR)技术是一种分子生物学诊断技术，以高度敏感这一优势，广泛用于检测乙肝病毒(HBV DNA)，成为一种临床辅助诊断的可靠工具。但PCR检测乙肝病毒(HBV DNA)的结果受多种因素的影响，有假阳性和假阴性的问题出现［2］。本研究主要通过对测定标本脂血、黄疸、溶血及常温储存3d和4℃保存7d对乙肝病毒。DNA(HBV DNA)PCR反应的影响，探讨实验中这些因素的干扰究竟有多大，为规范送检标本要求提供依据，对无法消除这些性状的标本的实验结果进行客观的判断分析。 1 资料与方法 1.1 检测试剂和仪器HBV DNA荧光定量PCR试剂盒(中山大学达安基因股份有限公司)及LightCycler荧光定量PCR扩增仪。血红蛋白在雅培CD3700血液分析仪测定。总胆红素、甘油三脂在OLYMPUS5400全自动系列化分析仪测定。 1.2 实验标本的选择实验标本的选择均为临床确诊乙型肝炎病人血清，HBV DNA的拷贝数104～108／ml。每份标本总胆红素、血脂均在正常范围，无溶血。 1.3 脂血标本的制备收集乳糜状混浊的血清，用正常人血清稀释成一定浓度。 1.4 黄疸标本的制备收集高胆红素血清，用正常人血清稀释成一定浓度。 1.5 溶血标本的制备将阳性血清离心后先留取30μl作为对照血清，然后将剩余的血标本用无菌竹签搅拌，然后置一200c冷冻10 min，37℃水浴融解后，4000r／min离心5min，取上清液400μl备用；然后依上法继续对原标本进行搅拌、冷冻、离心，获得若干份溶血程度不同的血清各400μl。其中每份吸取300／μl用于HBV DNA测定，另110μl用于血红蛋白测定。 1.6 正常血清的制备收集体检健康者血清，无黄疸、溶血和脂血。 1.7 取阳性血清标本即时检测、室温放置3d、4℃保存7d内检测。 1.8 检测高脂血和非脂血、黄疸和非黄疸、溶血血清和未溶血血清制成模板后，加入PCR反应液，同时上机作HBV DNA定量测定(具体方法按试剂盒操作)。 1.9 统计学处理将测定值换算成对数值，进行配对资料的t检验。 2 结果 2.1 标本不同储存时间对HBV DNA测定的影响 将血清标本室温储存3d、4℃保存7d后测定结果与即时标本测定结果进行配对资料的t检验，结果差异无显著性(P>0．05)，见表1。 表1 标本不同储存时间对HBV DNA测定的影响(略) 2.2 脂血标本(仅观察甘油三脂TG)对HBV DNA测定的影响TG含量mmoL／L表示，正常值0．34～1．71mmoL／L。通过对TG正常血清与不同浓度TG血清的HBV DNA的测定，其拷贝数经过换算成对数值，进行配对资料的t检验，结果差异无显著性(P>0．05)，见表2。 表2 正常血清与高血脂血清HBV DNA定量结果(略) 2.3 溶血标本对HBV DNA测定的影响 以血红蛋白(Hb)含量表示溶血程度，非溶血标本Hb<2g／L。通过测定不同程度溶血标本与非溶血标本HBV DNA，进行配对资料t检验，结果无显著性差异(P>0．05)，见表3。 表3 未溶血血清与溶血血清HBV DNA定量结果(略) 2.4 胆红素对HBV DNA测定的影响 我们用T—Bil含量(μmoL／L)表示黄疸程度，正常血清T—Bil含量为2～25／μmol／L。 通过对正常血清与不同浓度总胆红素血清的HBV DNA的测定，其拷贝数经过换算成对数值，进行配对资料的t检验，结果无显著性差异(P>0．05)，见表4。 表4 正常胆红素血清与黄疸血清HBV DNA定量结果 表1 标本不同储存时间对HBV DNA测定的影响(略) 3 讨论 PCR技术虽然具有高度的敏感性和特异性，但易受反应条件和实验条件因素影响外，标本状态也可能对HBV DNA的检测结果产生影响。在标本采集中标本的放置时间、温度，标本脂血、溶血、黄疸等因素是经常遇到的。本研究结果显示，血标本在室温下储存3d、4℃保存7d对PCR检测HBV DNA含量无显著差异(P>0．05)；脂血、溶血、黄疸对PCR检测HBV DNA无显著影响(P>0．05)。由于每天检测HBV DNA的标本量较少，不可能每天进行检测，因此很多医院把标本收集放置在室温l~3d或4℃的条件下7d检测l~2次。通过本实验证实血清标本在室温条件下储存1～3d、4℃保存7d对PCR检测。HBVDNA含量无显著差异。 在脂血方面，脂血标本浑浊主要由于乳糜微粒增多引起，血清乳糜微粒中84％~88％是甘油三脂(TG)，TG水平可以客观的反映脂血程度。本实验主要讨论TG对HBV DNA测定影响，有报道认为血脂中乳糜微粒能因光散射而导致的荧光淬灭作用使荧光信号降低并能通过抑制Taq酶活性降低扩增效率，从而干扰PCR结果造成假阴性。但本实验结果显示TG对检测结果没有产生影响，原因可能是通过采用高峰等人报道的方法，对脂血标本经高速冷冻离心处理已去除大部分乳糜微粒及标本处理过程中的多项稀释有关。理论上溶血标本对HBV DNA的检测有影响，有研究表明，血红素可通过起卟啉环与Taq酶的不可逆结合而抑制Taq酶的活性，从而影响PCR测定。本实验中对各种溶血程度的HBV DNA阳性标本进行检测，其结果与未溶血标本无显著性差异。胆红素对实验的干扰主要在于其本身的光吸收作用，但我们通过对不同浓度胆红素标本的HBV DNA测定，未发现有明显的干扰现象。原因可能也与标本处理过程中胆红素丢失和多次稀释有关。 本实验采用沉淀煮沸烈解法提取核酸模板，可去除标本中大部分干扰物质。脂血、溶血、黄疸影响因素比较，虽然统计学上无显著差异，但对每一个具体的患者，结果越接近真值越好，所以最好还是尽量使用无严重脂血、溶血、黄疸的标本。 来源：检验在线 |
